84消毒剂对乙型脑炎病毒灭活效果评价
依据2002年国家卫生健康委员会发布的《消毒技术规范》，采用悬液定量法，在实验室代表性材料（玻璃、彩钢、聚氯乙烯、不锈钢）表明上进行消毒剂-病毒相互作用，通过中和鉴定实验确定合适的中和剂，建立检测的新方法检测病毒活性，并对检测结果进行评价。
结果常温下，中和剂卵磷脂（10 g/L）、吐温 80（10 g/L）及其中和产物均导致宿主细胞（原代金黄地鼠肾细胞）死亡；中和剂硫代硫酸钠（1 g/L）及其中和产物对宿主细胞无毒性，对细胞生长无影响，对乙型脑炎病毒毒力无影响。故选择硫代硫酸钠（1 g/L）作为中和剂。用84消毒剂对乙型脑炎病毒进行病毒灭活实验，用硫代硫酸钠（1 g/L）中和后，用噬斑法对该混合物进行仔细的检测，未检测到乙型脑炎病毒。
结论有效氯含量为800 mg/L的84消毒剂与乙型脑炎病毒反应5 min后就可以有效灭活病毒，灭活效果达到预期。
流行性乙型脑炎（乙脑）病毒呈球状，是具包膜且包膜表面有血凝素的单链RNA病毒，为嗜神经性病毒，通过虫媒传播。乙脑也称日本脑炎，是经蚊虫叮咬感染乙脑病毒而引起的中枢神经系统性疾病，也是目前亚洲已知发病人数最多的病毒性脑炎。乙脑病毒可造成永久性神经损伤，给公共卫生和社会造成沉重负担。化学消毒方法将化学物质或化学混合物应用于无生命表面或材料上，以灭活生物因子或将其数量减少到安全水平，使用消毒剂通常是表面去污的首选方法。84消毒剂属含氯消毒剂，有效成分为次氯酸钠，具有毒性低、消毒效率高等优点，其分子小、不带电荷，能侵入细胞内与蛋白质发生氧化作用或破坏细胞内磷酸脱氢酶，从而发挥消毒作用，在控制病原微生物污染和传播等方面有着及其重要的作用。含氯消毒剂的消毒效果主要根据其有效氯浓度和作用时间，只有当二者达到一定量时才能有效灭活病原体。本研究拟使用84消毒剂通过浸泡法灭活乙脑病毒，检测实验用84消毒剂（有效氯含量800 mg/L）对乙脑病毒的灭活效果，并对该消毒剂灭活病毒的能力做验证性评价。
病毒悬液由成都生物制品研究所有限责任公司（成都公司）病毒性疫苗生产科室制备。实验用病毒为乙脑病毒SA14-14-2减毒株，宿主细胞为BHK-21原代金黄地鼠肾细胞，均由成都公司提供。经培养后收取的病毒液，即单一收获液，存储于DW-86L338J-80 ℃超低温冰箱（青岛海尔生物医疗股份有限公司）。本研究各项操作均在ESCO classⅡ生物安全二级实验室生物安全柜（新加坡ESCO生命科学公司）中进行。
消毒剂：实验用84消毒剂购自成都金山化学试剂有限公司，自行配制为有效氯含量800 mg/L的消毒剂，除菌过滤后备用。
载体材料：选择实验室装修代表性材料作为试验载体，包括塑料——聚氯乙烯板（用途：地板、密封条、塑料容器部件等）；玻璃——玻璃板（用途：观察窗、容器）；彩钢——彩钢板（用途：天花板、墙面等）；金属——不锈钢板（用途：工作台面、罐装设备），将4种载体切割为5 cm×5 cm大小备用。
主要试剂：新生牛血清、PBS购自美国ThermoFisher Scientific公司，硫代硫酸钠购自国药集团化学试剂有限公司，甲基纤维素购自美国Sigma公司，MEM培养基购自美国HyClone公司，碳酸氢钠购自河北华晨药业集团有限公司，卵磷脂购自上海麦克林生化科技股份有限公司。BHK-21生长液：体积分数10%新生牛血清、2%碳酸氢钠、5%MEM、除菌注射用水；病毒稀释液：5% MEM、2%碳酸氢钠、除菌注射用水；覆盖物：1%甲基纤维素、10%新生牛血清、5% MEM、2%碳酸氢钠、除菌注射用水；中和剂：1 g/L硫代硫酸钠、10 g/L卵磷脂、10 g/L 吐温80，均由PBS配制而成，并使用0.22 μm滤头过滤除菌。
消毒剂应在发生溢洒后使用，或在已知或怀疑已发生污染的地方使用。在发生溢洒情况时，实验人员首先考虑使用消毒剂将生物因子灭活。基于成都公司相关指南文件拟定的操作规程，本研究采用悬液定量法，在实验室常见4种材质（见1.1）表面滴加病毒液以及84消毒剂，相互作用后收集混合液，检测混合液中的病毒含量。
1.2.1.1细胞毒性实验由于噬斑法系统误差小、重复性好、结果客观可靠，可避免实验人员主观判定造成的系统误差，因此采用噬斑法测定病毒滴度，使用BHK-21作为检测细胞。
体外细胞毒性实验采用非间接接触实验，按形态学方法评定细胞损伤。在实验前首先确认实验所用中和剂及中和产物是否对该细胞产生毒性。根据中和剂相关验证方案，确定中和剂及中和剂使用量，选取消毒剂∶中和剂（体积比）=1∶50、1∶25做验证。将BHK-21接种至细胞板，培养2~3 d待长成单层细胞后，按照表1分组进行实验，各溶液与生长液体积比为1∶3，1~5 d内观察细胞状态，并记录细胞形态、生长情况。
1.2.1.2病毒毒力影响实验实验前，首先应确认1.2.1.1项筛选出的中和剂及中和产物（中和剂+消毒剂）是否对病毒毒性产生影响。
各实验组（表2）按病毒∶各溶液（体积比）=1∶100混合均匀，作用10 min后用病毒稀释液作10倍系列稀释。吸取样液200 μL，接种于单层细胞培养板，于（37±1） ℃、（4.5±0.5）%CO2培养箱中培养，5 d后染色计数，计算病毒滴度。每组实验重复3次。
绝大多数病毒的吸附可分为非特异性吸附和特异性吸附。前者为病毒依靠静电作用与宿主细胞接触而结合，后者为病毒表面蛋白质作为抗原与宿主细胞膜上相应的受体特异性识别并结合。本实验模拟病毒溢洒在固体表面的情况，部分病毒可能通过静电力附着在固体表面，故通过反复吹吸将病毒从载体表面冲洗至容器。回收率指标直接决定检测结果可靠性，测定回收后的病毒滴度是否与阳性对照存在一定的差异，并基于此验证消毒剂对病毒的灭活能力。
具体操作：分别取乙脑病毒单一收获液200 μL滴加于4种载体表面，0、5、30 min后，使用移液器将载体上的病毒液充分吹打至含有病毒稀释液的容器中，采用噬斑法测定病毒滴度。并计算病毒回收率。回收率=测定病毒滴度/原始病毒滴度×100%。
将有效氯含量为800 mg/L的84消毒剂与乙脑病毒混合后，加入1.2.1.1项筛选出的中和剂，作用一段时间后用噬斑法测定混合病毒液滴度。
实验组1：于4种载体表面分别滴加乙脑病毒单一收获液20 μL，再按照体积比1∶100分别滴加消毒剂2 mL，继续作用5、10、15 min。按消毒剂∶中和剂=1∶25分别滴加中和剂50 mL，将混合液从载体上洗脱，浸泡10 min，得到病毒-消毒剂-中和剂混合液，检测各混合液中病毒滴度对数值。
实验组2（阳性对照组）：将乙脑病毒单一收获液20 μL加至50 mL稀释液中，混匀后测定病毒滴度。
实验组3（阴性对照组）：将稀释液接种于BHK-21单层细胞板中，检测病毒滴度。
实验组4：取实验组1、2、3中的混合液进行细胞盲传实验，共进行3次盲传。显微镜下观察细胞生长状态，分别观察并记录细胞病变情况。
2.1.1细胞毒性实验按照细胞毒性形态学定性分级，分级大于2级则被认为有细胞毒性作用。以硫代硫酸钠为中和剂的实验组1、2、3中，细胞长势正常；分别以卵磷脂、吐温80为中和剂的实验组4、5、6和7、8、9中，细胞完全被破坏；实验组10（阳性对照组）细胞完全被破坏；实验组11（阴性对照组）细胞生长正常。结果见表3。根据结果得出，以1 g/L硫代硫酸钠作为中和剂对细胞生长无影响，其对应的中和产物（消毒剂∶中和剂体积比为1∶50或1∶25）均对细胞生长无影响。本研究选择1 g/L硫代硫酸钠作为84消毒剂的中和剂，用量选取消毒剂∶中和剂体积比为1∶25。
2.1.2病毒毒力影响实验结果为，实验组1中含消毒剂，与病毒混合作用后未检测出病毒，实验组5（阴性对照）中亦未检测到病毒。实验组2、3中，中和剂（硫代硫酸钠）、中和产物（消毒剂+硫代硫酸钠）与乙脑病毒混合作用后的病毒滴度在7.35~7.45 lgPFU/mL，实验组4（阳性对照）的病毒滴度在7.44~7.52 lgPFU/mL。对测定结果进行单因素方差分析，
P值＞0.05，说明中和剂及中和产物与病毒作用后的滴度与阳性对照的滴度间差异无统计学意义，中和剂和中和产物不可能影响病毒毒性且中和剂有效。结果见表4。
从4种载体表面收集的病毒液在3个不同时间点（0、5、30 min）的回收率在96.05%~100%，符合病毒感染性滴度回收率在80%~120%的要求，检测结果有效可靠，回收实验成立。结果见表5。
通过噬斑法检测混合液中的病毒滴度，结果显示，消毒剂与病毒混合后再加入中和剂进行中和，4种不同载体洗脱液中均不含乙脑病毒；阳性对照稀释液与病毒混合液中，3次实验结果分别为7.45、7.51和7.41 lgPFU/mL，平均滴度为7.46 lgPFU/mL。阴性对照未检测出乙脑病毒。
在细胞盲传实验中，仅阳性对照出现细胞病变效应，阴性对照及各载体上洗脱的混合液均未出现细胞病变情况，盲传结果为阴性，表明上述混合液中均无乙脑病毒存在。
在实验、生产的全部过程中，对化学消毒剂采取比较有效和准确的消毒效果评价，是保证消毒效果和消毒质量控制的前提，而在消毒剂消毒效果评价研究中，有效去除残留消毒剂是关键。对于残留消毒剂的去除，大致上可以分为化学中和法及物理法。物理法是通过稀释过滤及超速离心的方法将消毒剂与微生物样本分离。化学中和法主要是利用化学试剂间的拮抗作用将消毒剂中和，消除其对实验中微生物的持续杀灭和抑制作用，操作简单便捷、结果可靠，是目前使用最多的方法。
通常情况下，乙脑病毒对热抵抗力弱，56 ℃、30 min可被灭活，实验室灭活乙脑病毒一般会用高压、煮沸方法。由于生产的全部过程中若发生病毒漏洒等实验室安全问题，热灭活法不适用，因此就需要采取消毒剂灭活的方法。在病毒灭活验证实验中，由于大多数消毒剂、中和剂对细胞的毒性较强，在以细胞为介质检测病毒滴度时，可能会产生不真实结果，因此对中和剂的选择要求比较高，不仅要能有效终止消毒剂的残留毒性，同时该中和剂对实验细胞和病毒的生长均不可有不良影响。基于此，成分单一、浓度适宜的中和剂成为首选。本研究选用了3种常用中和剂，研究之后发现，卵磷脂（10 g/L）及吐温 80（10 g/L）及其与消毒剂作用形成的中和产物均对细胞生长有一定影响，最终确定使用硫代硫酸钠（1 g/L）作为中和剂。
本研究结果为，在实验室常见载体表面，有效氯含量为800 mg/L的84消毒剂在与乙脑病毒作用5 min后即可将病毒灭活。在此基础上，本研究对该消毒剂的终末消毒效果进行了评价，并建立了准确有效的消毒效果评价方法，为乙脑病毒的灭活效果检测提供了方法参考，为确保消毒场所（对象）的病毒清除、防止病毒传播奠定理论基础。
曾兰义1 罗辉艳2 彭维1 江虹霞1 廖海棠1 马玉晓1 罗明杰1 刘菊1
1成都生物制品研究所有限责任公司质量检定室，成都 610023；2四川省疫苗工程技术研究中心，成都 610023
引用本文：曾兰义, 罗辉艳, 彭维, 等.84消毒剂对乙型脑炎病毒灭活效果评价[J]. 国际生物制品学杂志, 2025, 48(4): 266-270.
